大小鼠条件性恐惧实验测试方法总结（精华篇）

概述

经典条件性恐惧，是评估恐惧学习和记忆的可靠模型。在条件性恐惧期间，动物学会将先前的非威胁性刺激（指-定为条件刺激或CS）与先天有害刺激（指-定为非条件刺激或US）联系起来。如果这种CS-US关联被成功学习和记住，先前中性的CS本身将成为US的预测因子，从而引发原来US触发的恐惧反应（指-定为条件反应或CR）。另外，在此过程中，动物还会学习到情境与US的关联。

实验设备

条件性恐惧实验设备的主要和基本组成部分是：条件性恐惧测试室、隔音通风箱和控制软件。测试室具有导电格栅的地板、电击发生器以及红外探测器，测试室通常由透明有机玻璃制成，可将小鼠的嵌套在大鼠的测试室中。其实大鼠尺寸的测试室也可以用于小鼠。为了防止动物在受到厌恶刺激时会跳出测试室，强烈建议测试室设置为有顶盖的。测试室放置在隔音箱中，隔音箱配备有一个照明灯、一个小风扇、声音发生器以及一个与声音发生器相联的扩音器、摄像机和录音设备。风扇用于通风和产生背景噪音，这对于以声音作为CS的情况尤其重要。不同刺激的呈现由具有相应软件的计算机控制。

VisuFcs条件性恐惧实验系统，型号：XR-XC404,上海欣软

动物的行为通常由安装在顶部的摄像机或位于测试室周围框架中的红外传感器记录。视频记录或来自红外传感器的信号可以使用指-定的软件自动分析。另一种选择是在事件记录器软件的帮助下人工分析视频记录。其他组件包括用于改变测试环境外观的备用地板和墙板等。特定的测试室尺寸可能会有所不同，但是它们必须适合动物（例如，格栅地板间距对大鼠来说更宽），并允许自由移动和探索。对于听觉条件恐惧范式，可以安装一个动物不可见的LED指示灯在测试小室内，可以用于在没有音轨的视频记录上指示声音刺激的呈现。

实验动物

1、由于跨物种恐惧环路的保守性，所有品系的实验室大鼠和小鼠都可用于经典的条件性恐惧范式。一般来说，条件性恐惧行为测试的一个重要考虑因素是啮齿动物在实验时的年龄。条件性恐惧反射可以在任何年龄的动物身上建立，然而，在非常年幼和青少年的动物中，学习和记忆表型与成年动物有很大的不同。对于学习和记忆能力缺陷或增强的一般表型，一般使用成年动物（通常周龄在8至16周之间）。

2、从实验动物供应商处订购进入设施的动物应被允许适应新的饲养条件一周或更长时间。

3、实验动物应饲养在光照、温度和潜在应激源（如笼子变化、同笼数量或其他干扰）的统一条件下。

4、除非情况要求单笼饲养（如手术后的动物或具有高度攻击性的动物），否则不应单独饲养啮齿动物，因为这可能会对行为结果产生不利影响。大鼠通常每个笼子饲养两到三只，而每个笼子最多可以饲养五只小鼠。对于具有攻击性的小鼠品系，例如C57BL/6小鼠，每笼饲养的雄性小鼠少于5只可能是最佳的。

5、每个实验组所需的动物数量应通过功效分析确定。通常一般情况下7-10只大鼠或10-15只小鼠可以提供足够的统计功效。

关键参数

1. CS

在经典条件性恐惧实验中，CS几乎可以是任何离散的非威胁性线索，例如声音，光线或气味。在听觉条件性恐惧中，常用的CS是一种使用单一频率音调的中性非有害声音, 例如，2-10 kHz范围内的听觉刺激，其强度约为80 dB。CS呈现的持续时间因研究而异，范围从2 s到30 s不等。

2. US

US是有害的或轻度疼痛的。最-常-用的US是轻度电击，电刺激的优点是它们的参数定明确，并且易于控制和管理。如果对动物的脚施加电刺激，它们也被称为“足部电击”。电刺激的强度和持续时间不同，强度可能在 0.4 至 1 mA之间变化，持续时间通常为 0.5 s至 2 s 之间。

3. 跟踪配对刺激

当 CS 和 US 在整个测试中重复出现但两者不是同时出现时，称为跟踪配对刺激（图1）。US通常在CS呈现结束后的相对较短的固定时间间隔内出现，一般约10 - 20 s，但足以在CS和US之间形成联系。但是几个CS-US配对之间时间间隔要长一些，大约2.5 - 4.5 min。

4. 延迟配对刺激

当US与CS的呈现共同终止（即，电击在CS结束时精确地传递），这被称为延迟配对刺激（图1）。在正常情况下，条件反应在延迟配对刺激处理中比在跟踪配对刺激中更强，因为CS-US配对在时间上更紧密地联系在一起。跟踪配对刺激激活海马，而延迟配对刺激主要激活杏仁核。因此，选择哪种范式将取决于所要解决的科学问题。

图 1：跟踪配对刺激与延迟配对刺激条件性恐惧的示意图

实验程序（测试方法）

1、线索条件性恐惧测试（cued fear conditioning）

2、情境条件性恐惧测试

3、恐惧增强性惊吓

4、条件性恐惧记忆的消退

冻结时间通常表示为 CS 持续时间的百分比，并在每次测试中取平均值。例如，如果一只动物在30秒的长CS呈现过程中冻结了24秒，就代表它在该试验中显示出80%的冻结反应。评价情境恐惧时，可以使用冻结时间占整个测试持续时间的百分比作为统计指标。对于消退测试，应对测试中的每个CS进行单独分析，而不是取平均值，因为冻结行为会逐渐减少。如果CS呈现的数量非常多，单独分析每个CS下的冻结行为导致曲线非常杂乱，则可以将连续几个（2-5个）CS作为一个试验块，将每个试验块的数据平均，这可能有助于简化曲线。在情境恐惧消退的情况下，可以将测试分解为例如 1 或 2 分钟的间隔，以评估恐惧消退的获得。另一个不太常用的参数是冻结行为次数，以总数表示。

惊吓反应显示出一定程度的个体内和个体间变异性，因此需要进行较多试验，并且推荐匹配方式分组，即根据基线惊吓反应将小鼠或大鼠分配到实验组和对照组，以确保在实际实验开始之前各组均值彼此之间没有差异。除了恐惧CS 惊吓刺激试验外，还包含单独的惊吓刺激试验。对“单独惊吓”和“CS惊吓”的平均反应的差异称为恐惧增强，以绝对值或“单独惊吓”幅度的百分比变化来表示。

通常建议不要只分析条件性恐惧的单一测量，特别是如果使用的设置和/或方案允许测试更多的恐惧反应。例如，动物可以将恐惧反应从冻结行为转换为逃跑反应。这种逃跑反应也可以通过跟踪软件中的速度阈值自动检测。如果不知道逃跑反应在实验中增加，那么在这个实验中观察到冻结减少将被错误地解释为恐惧减少。